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　　3、法包括步骤 ： (1) 将聚乙二 醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中， 在 60-90 条件下得到如式 II 所示的化合物 ； (2) 将式 II 化合物、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 脱水剂和有机 碱混合， 得到如式 III 所示的化合物 ； 所述的脱 水剂选自 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰 二亚胺盐酸盐、 N， N- 二异丙基碳二亚胺、 或 N， N- 二环己基碳二亚胺 ； 所说的有机碱选自 N- 甲 基吗啉、 三乙胺、 吡啶、 或二甲氨基吡啶 ； (3) 将 式 III 化合物和半胱氨酸混合， 得到如式 IV 所 示的化合物 ； 和 (4) 将式 IV 化合物和二硫苏糖 醇。

　　4、混合， 得到如式 I 所示的化合物。本发明还 提供了可靠的式 I 所示的化合物的鉴定方法。 n 3-125。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王海 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 2 页 CN 101768263 B1/2 页 2 1. 一种如式 I 所示的化合物的制备方法， 其特征在于， 所述的方法包括步骤 ： (1) 将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中， 在 60-90条件下反应得到如式 II 所示的化合物 ； (2) 将式 II 化合物、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 脱水剂和有机碱混合， 得到如式 III。

　　5、 所示的化 合物 ； 所述的脱水剂选自 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺盐酸盐、 N， N- 二异丙 基碳二亚胺、 或 N， N- 二环己基碳二亚胺 ； 所说的有机碱选自 N- 甲基吗啉、 三乙胺、 吡啶、 或 二甲氨基吡啶 ； (3) 将式 III 化合物和半胱氨酸混合， 得到如式 IV 所示的化合物 ； 和 (4) 将式 IV 化合物和二硫苏糖醇混合， 得到如式 I 所示的化合物 ； 步骤 (1) 的反应在吡啶存在下进行 ； 步 骤 (2) 中 式 II 化 合 物、 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺、 脱 水 剂 和 有 机 碱 的 摩 尔 比 为 1 1 1 3。

　　6、-1 6 2 6 ； 步骤 (3) 的反应在 pH7.4 的缓冲液中进行 ； 将式 IV 化合物和二硫苏糖醇混合于 pH8.6 的缓冲液中 ； 其中， n 3-125。 权 利 要 求 书 CN 101768263 B2/2 页 3 2. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐的摩尔比 为 1 1-8。 3.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中脱水剂为1-乙基-3-(3-二 甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺盐酸盐 ； 有机碱为 N- 甲基吗啉。 4.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中将式III化合物和半胱氨酸 在 pH7.。

　　7、4 的缓冲液中混合， 然后进行硅胶层析分离得到如式 IV 所示的化合物。 5. 如权利要求 4 所述的制备方法， 其特征在于， 硅胶层析流动相为二氯甲烷甲醇 7-12 1。 6. 如权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 (4) 中式 IV 化合物和二硫苏糖醇 的摩尔比为 1 1-3.5。 权 利 要 求 书 CN 101768263 B1/8 页 4 一种可用于制备长循环脂质体的巯基化聚乙二醇的合成方 法 技术领域 0001 本发明涉及化学合成领域， 具体涉及一种巯基化聚乙二醇衍生物的合成方法。 背景技术 0002 脂质体是一种磷脂双分子层构成的递药载体， 具有很多优点， 但是进。

　　8、入血液循环 后， 容易被网状内皮系统吞噬， 半衰期很短， 而在脂质体膜表面引入聚合物分子后可形成空 间稳定的脂质体。研究最为广泛的聚合物是聚乙二醇。本发明研制的巯基化聚乙二醇可 以与马来酰亚胺化的磷脂反应生成聚乙二醇化的磷脂， 从而制备出具有长循环作用的脂质 体 ； 还可以与含有巯基的蛋白反应生成聚乙二醇化的蛋白， 从而使该蛋白不易被网状内皮 系统吞噬。 0003 巯基化聚乙二醇的合成方法已有文献报道 ： Suzuki等(Biochimica etBiophysica Acta.1245(1995)9-16) 将聚乙二醇单甲醚在 40与琥珀酸酐反应生成聚乙二醇 - 琥珀酸 酯 (II)， 再与。

　　9、 N- 羟基琥珀酰亚胺在脱水剂存在的条件下反应， 生成聚乙二醇 - 琥珀酰亚胺 酯 (III)， 再通过与胱氨酸反应生成聚乙二醇 - 胱氨酸 (IV)， 经二硫苏糖醇 (DTT) 断键， 通 过葡聚糖凝胶柱分离得到产品 (I)。按文献方法在合成 (II) 时使用氯仿作为溶剂， 40反 应 4h， 结果仍有大量原料未反应 ； 在制备 (III) 的过程中， 按文献的方法难以进行， 得不到 相应的中间体 ； 按文献的方法合成 (IV) 后， 不经分离纯化就直接断 (IV) 的二硫键， 通过葡 聚糖凝胶分离， 难以得到高纯度的巯基化聚乙二醇 ； 并且文献缺乏对巯基化聚乙二醇衍生 物的可靠鉴定方法。 。

　　10、0004 因此， 本领域迫切需要提供一种如式 I 所示的巯基化聚乙二醇的制备方法， 所述 的方法不仅可以有效进行， 而且可以得到纯度高的式 I 化合物。 0005 0006 n 3-125 ； 优选 n 30-60。 发明内容 0007 本发明旨在提供一种式 I 化合物的新的制备方法。 0008 本发明中， 提供了一种如式 I 所示的化合物的制备方法， 所述的方法包括步骤 ： 0009 (1) 将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中， 在 60-90条件下反应得到如 说 明 书 CN 101768263 B2/8 页 5 式 II 所示的化合物 ； 0010 (2) 将式 II 化合物、 N-。

　　11、 羟基琥珀酰亚胺、 脱水剂和有机碱混合， 得到如式 III 所示 的化合物 ； 所述的脱水剂选自 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺盐酸盐、 N， N- 二 异丙基碳二亚胺、 或 N， N- 二环己基碳二亚胺 ； 所说的有机碱选自 N- 甲基吗啉、 三乙胺、 吡 啶、 或二甲氨基吡啶 ； 0011 (3) 将式 III 化合物和半胱氨酸混合， 得到如式 IV 所示的化合物 ； 和 0012 (4) 将式 IV 化合物和二硫苏糖醇混合， 得到如式 I 所示的化合物。 0013 在另一优选例中， 聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐的摩尔比为 1 1-8。 0014 在另一优选例中， 步。

　　12、骤 (1) 的反应在吡啶存在下进行。 0015 在另一优选例中， 步骤 (2) 中式 II 化合物、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 脱水剂和有机碱 的摩尔比为 1 1 1 3-1 6 2 6。 0016 在另一优选例中， 步骤 (2) 中脱水剂为 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚 胺盐酸盐 ； 有机碱为 N- 甲基吗啉。 0017 在另一优选例中， 步骤 (3) 的反应在 pH7.4 的缓冲液中进行。 0018 在另一优选例中， 步骤 (3) 中将式 III 化合物和半胱氨酸在 pH7.4 的缓冲液中混 合， 然后进行硅胶层析分离得到如式 IV 所示的化合物。 0019 在另一。

　　13、优选例中， 硅胶层析流动相为二氯甲烷甲醇 7-12 1。 0020 在另一优选例中， 步骤 (4) 中式 IV 化合物和二硫苏糖醇的摩尔比为 1 1-3.5。 0021 在另一优选例中， 将式 IV 化合物和二硫苏糖醇混合于 pH8.6 的缓冲液中。 0022 据此， 本发明提供了一种如式 I 所示的巯基化聚乙二醇的制备方法， 所述的方法 不仅可以有效进行， 而且可以得到纯度高的式 I 化合物。 附图说明 0023 图 1 显示了本发明提供的式 I 化合物的制备方法流程图。 0024 图2中的1显示了实施例1得到的式I化合物的薄层层析结果 ； 而其中的2和3都 是当在第三步时， 没有经过硅胶层。

　　14、析步骤， 而通过第四步得到的化合物 I 的薄层层析结果。 具体实施方式 0025 发明人经过研究， 发现了一种新的式 I 化合物的制备方法， 所述的方法包括步骤 如图 1 所示 ： 0026 (1) 将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中， 在 60-90条件下得到如式 II 所示的化合物 ； 0027 (2) 将式 II 化合物、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 脱水剂和有机碱混合， 得到如式 III 所示 的化合物 ； 所述的脱水剂选自 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺盐酸盐、 N， N- 二 异丙基碳二亚胺、 或 N， N- 二环己基碳二亚胺 ； 所说的有机碱选自 N- 。

　　15、甲基吗啉、 三乙胺、 吡 啶、 或二甲氨基吡啶 ； 0028 (3) 将式 III 化合物和半胱氨酸混合， 得到如式 IV 所示的化合物 ； 和 0029 (4) 将式 IV 化合物和二硫苏糖醇混合， 得到如式 I 所示的化合物。 0030 本发明步骤 (1) 在氯仿中的反应温度为 60-90， 使反应速度加快 ； 发明人意外地 说 明 书 CN 101768263 B3/8 页 6 发现， 在步骤(2)中使用有机碱可以使反应顺利进行 ； 另外发明人在步骤(3)中通过使用硅 胶层析， 得到纯化的式 IV 化合物， 从而进一步提高的终产物式 I 化合物的纯度。 0031 另外， 发明人还提供了可。

　　17、中， 再依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、 脱水剂和有机碱， 脱 水生成 (III) ； 0043 3)、 将胱氨酸分散于 pH7.4 的缓冲溶液中， 加入 (III) 并不断用无机碱调节 pH 7.4， 脱 N- 羟基琥珀酸亚胺生成 (IV) ； 0044 4)、 将 (IV) 溶于 pH8.6 的缓冲液中， 通过加入二硫苏糖醇断二硫键生成 (I)。 0045 以上各步骤中， 合成 (II) 时， 以氯仿为溶剂， 反应温度为 60-90 ； 聚乙二醇单甲 醚与琥珀酸酐的摩尔比为 1 1-1 8， 优选 1 5 ； 最后通过重结晶收集 (II) 产物。 0046 在合成 (III) 时， 所说的脱水。

　　18、剂选自 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺 盐酸盐、 N， N- 二异丙基碳二亚胺、 或 N， N- 二环己基碳二亚胺， 优选 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨 基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐 ； 所说的有机碱选自N-甲基吗啉、 三乙胺、 吡啶、 或二甲氨基吡 啶， 优选 N- 甲基吗啉。 0047 当所使用的脱水剂为 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺盐酸盐， 有机碱 为 N- 甲基吗啉时， (III)、 N- 羟基琥珀酰亚胺、 1- 乙基 -3-(3- 二甲氨基丙基 )- 碳酰二亚胺 盐酸盐和 N- 甲基吗啉的摩尔比为 1 1 1 3-1 6 2 6。

　　20、几乎无碎片离子， 适合与聚合物或 蛋白质分子量的测定。聚乙二醇是由不同聚合度的分子构成的混合物， 在 MALDI-TOF 图谱 上它的分力量分布呈正态分布， 每一个峰代表一个聚合度的分子。 0051 本发明提到的上述特征， 或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用， 说明书中所揭示的各个特征， 可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特 说 明 书 CN 101768263 B5/8 页 8 征的一般性例子。 0052 本发明的主要优点在于 ： 0053 1、 反应速度快 ； 0054 2、 。

　　21、得到的式 I 化合物纯度高。 0055 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则所有的百分数、 比率、 比例、 或份数按 重量计。 0056 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的， 例如是指在 100 毫升的溶液中溶质的重量。 0057 除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳。

　　22、实施方法与材料仅作示范之用。 0058 本发明实施例中所述的薄层层析是硅胶薄层层析， 流动相为二氯甲烷甲醇 7.5 1。 0059 实施例 1 0060 制备式 I 化合物 A 0061 第一步 ： 在 100ml 三颈瓶中加入 30ml 氯仿、 聚乙二醇 2000 单甲醚 (2.0g， 1mmol)、 琥珀酸酐 (0.603g， 6mmol) 和 0.5ml 吡啶， 60油浴加热回流搅拌 4h， 用 10ml 0.5M 盐酸 洗涤一次， 再用水 10ml 洗涤两次， 除去水层， 用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中， 减压蒸馏除去氯仿层， 经乙酸乙酯重结晶得。

　　27、7 实施例 2 0068 制备式 I 化合物 B 0069 第一步 ： 在 1000ml 三颈瓶中加入 300ml 氯仿、 聚乙二醇 2000 单甲醚 (20.0g， 10mmol)、 琥珀酸酐(8.1g， 80mmol)和5ml吡啶， 80油浴加热回流搅拌4h， 用100ml0.5M盐 酸洗涤一次， 再用水 100ml 洗涤两次， 除去水层， 用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过夜滤掉硫酸 钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中， 减压蒸馏除去氯仿层， 经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000- 琥珀酸酯 (II)， 收率 83.21。 0070 第二步 ： 在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、 第。

　　29、.4 的 HBS 缓冲液 50ml， 将胱氨 酸 (1.44g， 6mmol) 混悬于缓冲液中， 称取第二步得到的聚乙二醇 2000- 琥珀酰亚胺 (III) (4.42g， 2mmol)少量多次加到缓冲液中， 并不断搅拌， 同时用pH计监测pH值的变化， 用0.5M NaOH 调节 pH 值为 7.4， 室温反应 12h， 过滤除去不溶固体， 滤液中加入甲苯 50ml， 抽真空蒸 干溶剂， 重复几次， 将得到固体用硅胶层析柱分离， 流动相二氯甲烷甲醇 10 1， 合并 洗脱液为 (IV) 的溶媒， 蒸干得到聚乙二醇 2000- 胱氨酸 (IV)2.59g。 0071 第四步 ： 在 50ml。

　　31、 C 0075 第一步 ： 在 100ml 三颈瓶中加入 30ml 氯仿、 聚乙二醇 2000 单甲醚 (2.0g， 1mmol)、 琥珀酸酐 (0.10g， 1mmol) 和 0.5ml 吡啶， 60油浴加热回流搅拌 4h， 用 10ml 0.5M 盐酸 洗涤一次， 再用水 10ml 洗涤两次， 除去水层， 用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中， 减压蒸馏除去氯仿层， 经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000- 琥珀酸酯 (II)0.873g， 收率 39.45。 0076 第二步 ： 在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、 第一步得到的聚乙二醇2000。

　　33、加入 0.05M pH 7.4 的 HBS 缓冲液 50ml， 将胱氨酸 (1.20g， 5mmol) 混悬于缓冲液中， 称取第二步得到的聚乙二醇 2000- 琥珀酰亚胺 (III) (4.42g， 2mmol)少量多次加到缓冲液中， 并不断搅拌， 同时用pH计监测pH值的变化， 用0.5M NaOH 调节 pH 值为 7.4， 室温反应 12h， 过滤除去不溶固体， 滤液中加入甲苯 50ml， 抽真空蒸 干溶剂， 重复几次， 将得到固体用硅胶层析柱分离， 流动相二氯甲烷甲醇 10 1， 合并 洗脱液为 (IV) 的溶媒， 蒸干得到聚乙二醇 2000- 胱氨酸 (IV)2.47g。 0078 。

　　35、60油浴加热回流搅拌 4h， 用 10ml 0.5M 盐酸 洗涤一次， 再用水 10ml 洗涤两次， 除去水层， 用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中， 减压蒸馏除去氯仿层， 经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000- 琥珀酸酯 (II)0.727g， 收率 34.41。 0082 第二步 ： 在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、 第一步得到的聚乙二醇2000-琥 珀酸酯 (II)(8.0g， 3.79mmol)、 N- 羟基琥珀酰亚胺 (0.35g， 3.00mmol)、 1- 乙基 -3-(3- 二甲 氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.709g， 3。

　　42、 0093 第一步 ： 在 100ml 三颈瓶中加入 30ml 氯仿、 聚乙二醇 2000 单甲醚 (2.0g， 1mmol)、 琥珀酸酐 (0.603g， 6mmol) 和 0.5ml 吡啶， 60油浴加热回流搅拌 4h， 用 10ml 0.5M 盐酸 洗涤一次， 再用水 10ml 洗涤两次， 除去水层， 用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过夜滤掉硫酸钠， 再将氯仿层转移到圆底烧瓶中， 减压蒸馏除去氯仿层， 经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇 2000- 琥珀酸酯 (II) 收率 84.67。 0094 第二步 ： 在 100ml 三颈瓶中加入 25ml 二氧六环、 第一步得到的聚乙二醇 2000- 琥 。

　　43、珀酸酯 (II)(1.5g， 0.7mmol)、 N- 羟基琥珀酰亚胺 (0.245g， 3mmol) 和 1- 乙基 -3-(3- 二甲 氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.383g， 2mmol)， 50油浴加热搅拌反应8h， 用薄层色谱显 示无 (III) 生成。 0095 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并非用以限定本发明的实质技术内容范 围， 本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中， 任何他人完成的技术 实体或方法， 若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同， 也或是一种等效的变更， 均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。 说 明 书 CN 101768263 B1/2 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 101768263 B2/2 页 13 图 2 说 明 书 附 图 。

　　本发明公开了一种如式I所示的化合物的制备方法。所述的方法包括步骤：(1)将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中，在60-90℃条件下得到如式II所示的化合物；??(2)将式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱混合，得到如式III所示的化合物；所述的脱水剂选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐、N，N-二异丙基碳二亚胺、或N，N-二环己基碳二亚胺；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、吡啶、或二甲氨基吡啶；(3)将式III化合物和半胱氨酸混合，得到如式IV所示的化合物；和(4)将式IV化合物和二硫苏糖醇混合，得到如式I所示的化合物。本发明还提供了可靠的式I所示的化合物的鉴定方法。n＝3-125。

　　1.一种如式I所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(1)将聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐混合于氯仿中，在60-90℃条件下反应得到如式II所示的化合物；(2)将式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱混合，得到如式III所示的化合物；所述的脱水剂选自1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐、N，N-二异丙基碳二亚胺、或N，N-二环己基碳二亚胺；所说的有机碱选自N-甲基吗啉、三乙胺、吡啶、或二甲氨基吡啶；(3)将式III化合物和半胱氨酸混合，得到如式IV所示的化合物；和(4)将式IV化合物和二硫苏糖醇混合，得到如式I所示的化合物；步骤(1)的反应在吡啶存在下进行；步骤(2)中式II化合物、N-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂和有机碱的摩尔比为1∶1∶1∶3-1∶6∶2∶6；步骤(3)的反应在pH7.4的缓冲液中进行；将式IV化合物和二硫苏糖醇混合于pH8.6的缓冲液中；其中，n＝3-125。 2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，聚乙二醇单甲醚和琥珀酸酐的摩尔比为1∶1-8。 3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中脱水剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐；有机碱为N-甲基吗啉。 4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将式III化合物和半胱氨酸在pH7.4的缓冲液中混合，然后进行硅胶层析分离得到如式IV所示的化合物。 5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，硅胶层析流动相为二氯甲烷∶甲醇＝7-12∶1。 6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中式IV化合物和二硫苏糖醇的摩尔比为1∶1-3.5。

　　脂质体是一种磷脂双分子层构成的递药载体，具有很多优点，但是进入血 液循环后，容易被网状内皮系统吞噬，半衰期很短，而在脂质体膜表面引入聚 合物分子后可形成空间稳定的脂质体。研究最为广泛的聚合物是聚乙二醇。本 发明研制的巯基化聚乙二醇可以与马来酰亚胺化的磷脂反应生成聚乙二醇化 的磷脂，从而制备出具有长循环作用的脂质体；还可以与含有巯基的蛋白反应 生成聚乙二醇化的蛋白，从而使该蛋白不易被网状内皮系统吞噬。

　　巯基化聚乙二醇的合成方法已有文献报道：Suzuki等(Biochimica et Biophysica Acta.1245(1995)9-16)将聚乙二醇单甲醚在40℃与琥珀酸酐反应 生成聚乙二醇-琥珀酸酯(II)，再与N-羟基琥珀酰亚胺在脱水剂存在的条件下 反应，生成聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(III)，再通过与胱氨酸反应生成聚乙二醇- 胱氨酸(IV)，经二硫苏糖醇(DTT)断键，通过葡聚糖凝胶柱分离得到产品(I)。 按文献方法在合成(II)时使用氯仿作为溶剂，40℃反应4h，结果仍有大量原料 未反应；在制备(III)的过程中，按文献的方法难以进行，得不到相应的中间体； 按文献的方法合成(IV)后，不经分离纯化就直接断(IV)的二硫键，通过葡聚糖 凝胶分离，难以得到高纯度的巯基化聚乙二醇；并且文献缺乏对巯基化聚乙二 醇衍生物的可靠鉴定方法。

　　第一步：在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚 (2.0g，1mmol)、琥珀酸酐(0.603g，6mmol)和0.5ml吡啶，60℃油浴加热回流 搅拌4h，用10ml 0.5M盐酸洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用 无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减 压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇2000-琥珀酸酯(II)，收 率85.34％。由MALDI-TOF得到一系列M+钠峰：1959、2003、2048、2091、2136、 2180、2224、2268、2312、2356等。

　　第二步：在100ml三颈瓶中加入25ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)(1.5g，0.7mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.245g，3mmol)、1- 乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.383g，2mmol)和N-甲基吗啉 (0.61g，6mmol)，50℃油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿30ml复溶，用 0.5M盐酸每次10ml洗涤三次，分离水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出 去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III)1.14g。

　　第三步：在100ml烧杯中加入0.05M pH＝7.4的HBS缓冲液50ml，将胱氨 酸(1.93g，8mmol)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(III)(4.42g，2mmol)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测 pH值的变化，用0.5M NaOH调节pH值为7.4，室温反应12h，过滤除去不溶固 体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层 析柱分离，流动相二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，合并洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得 到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.67g。

　　第四步：在50ml三颈瓶中，加入10ml pH＝8.6的1M Tris-HCl缓冲液， 加入第三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)(2.2g，0.5mmol)，再加入二硫苏 糖醇(77mg，0.5mmol)，室温反应1h，用葡聚糖凝胶G-50分离，以pH＝6.8的 0.05M HBS缓冲液洗脱，合并含有聚乙二醇2000-半胱氨酸(即巯基化聚乙二 醇)(式I化合物A)的洗脱液，蒸干溶剂得到2.08g，收率94.54％，于-20℃冰 箱充氮气保存，用MALDI-TOF得到式I化合物A的质谱。

　　第一步：在1000ml三颈瓶中加入300ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚 (20.0g，10mmol)、琥珀酸酐(8.1g，80mmol)和5ml吡啶，80℃油浴加热回流搅 拌4h，用100ml0.5M盐酸洗涤一次，再用水100ml洗涤两次，除去水层，用无 水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压 蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇2000-琥珀酸酯(II)，收率 83.21％。

　　第二步：在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)(8.0g，3.79mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(1.54g，18.9mmol)、 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.383g，2mmol)和N-甲基吗 啉(0.61g，6mmol)，50℃油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿150ml复溶， 用0.5M盐酸每次40ml洗涤三次，分离水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤 出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III)6.12g。第三步：在 100ml烧杯中加入0.05M pH＝7.4的HBS缓冲液50ml，将胱氨酸(1.44g，6mmol) 混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺 (III)(4.42g，2mmol)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测pH 值的变化，用0.5M NaOH调节pH值为7.4，室温反应12h，过滤除去不溶固体， 滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层析柱 分离，流动相二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，合并洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得到聚 乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.59g。

　　第四步：在50ml三颈瓶中，加入10ml pH＝8.6的1M Tris-HCl缓冲液， 加入第三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)(2.2g，0.5mmol)，再加入二硫苏 糖醇(108mg，0.7mmol)，室温反应1h，用葡聚糖凝胶G-50分离，以pH＝6.8的 0.05M HBS缓冲液洗脱，合并含有聚乙二醇2000-半胱氨酸(即巯基化聚乙二 醇)(式I化合物B)的洗脱液，蒸干溶剂得到2.12g，收率96.36％，于-20℃冰 箱充氮气保存。

　　第一步：在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚 (2.0g，1mmol)、琥珀酸酐(0.10g，1mmol)和0.5ml吡啶，60℃油浴加热回流搅 拌4h，用10ml 0.5M盐酸洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无 水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压 蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇2000-琥珀酸酯(II)0.873g， 收率39.45％。

　　第二步：在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)(8.0g，3.79mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.45g，3.80mmol)、 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.728g，3.8mmol)和N-甲基 吗啉(1.11g，11.0mmol)，50℃油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿150ml 复溶，用0.5M盐酸每次40ml洗涤三次，分离水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III)2.69g。

　　第三步：在100ml烧杯中加入0.05M pH＝7.4的HBS缓冲液50ml，将胱氨 酸(1.20g，5mmol)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(III)(4.42g，2mmol)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测 pH值的变化，用0.5M NaOH调节pH值为7.4，室温反应12h，过滤除去不溶固 体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层 析柱分离，流动相二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，合并洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得 到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.47g。

　　第一步：在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚 (2.0g，1mmol)、琥珀酸酐(0.08g，0.8mmol)和0.5ml吡啶，60℃油浴加热回流 搅拌4h，用10ml 0.5M盐酸洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用 无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减 压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇2000-琥珀酸酯 (II)0.727g，收率34.41％。

　　第二步：在500ml三颈瓶中加入125ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)(8.0g，3.79mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.35g，3.00mmol)、 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.709g，3.7mmol)和N-甲基 吗啉(1.11g，11.0mmol)，50℃油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿150ml 复溶，用0.5M盐酸每次40ml洗涤三次，分离水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层， 过滤出去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III)2.34g。

　　第三步：在100ml烧杯中加入0.05M pH＝7.4的HBS缓冲液50ml，将胱氨 酸(0.96g，4mmol)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(III)(4.42g，2mmol)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测 pH值的变化，用0.5M NaOH调节pH值为7.4，室温反应12h，过滤除去不溶固 体，滤液中加入甲苯50ml，抽真空蒸干溶剂，重复几次，将得到固体用硅胶层 析柱分离，流动相二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，合并洗脱液为(IV)的溶媒，蒸干得 到聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)2.51g。

　　第四步：在50ml三颈瓶中，加入10ml pH＝8.6的1M Tris-HCl缓冲液， 加入第三步得到的聚乙二醇2000-胱氨酸(IV)(2.2g，0.5mmol)，再加入二硫苏 糖醇(154.2mg，1mmol)，室温反应1h，用葡聚糖凝胶G-50分离，以pH＝6.8的 0.05M HBS缓冲液洗脱，合并含有聚乙二醇2000-半胱氨酸(即巯基化聚乙二 醇)(式I化合物D)的洗脱液，蒸干溶剂得到2.12g，收率96.36％，于-20℃冰 箱充氮气保存。

　　第一步：在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚 (2.0g，1mmol)、琥珀酸酐(0.41g，4mmol)和0.5ml吡啶，60℃油浴加热回流搅 拌4h，用10ml 0.5M盐酸洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用无 水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减压 蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇2000-琥珀酸酯(II)1.66g， 收率78.41％。

　　第二步：在100ml三颈瓶中加入25ml二氧六环、第一步得到的聚乙二醇 2000-琥珀酸酯(II)(1.5g，0.7mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.245g，3mmol)、1- 乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳酰二亚胺盐酸盐(0.383g，2mmol)和N-甲基吗啉 (0.61g，6mmol)，50℃油浴加热搅拌反应8h，蒸干溶剂，用氯仿30ml复溶，用 0.5M盐酸每次10ml洗涤三次，分离水层，用无水硫酸钠干燥氯仿层，过滤出 去硫酸钠，减压蒸馏得到聚乙二醇2000-琥珀酰亚胺(III)1.23g。

　　第三步：在100ml烧杯中加入0.05M pH＝7.4的HBS缓冲液50ml，将胱氨 酸(1.44g，6mmol)混悬于缓冲液中，称取第二步得到的聚乙二醇2000-琥珀酰亚 胺(III)(4.42g，2mmol)少量多次加到缓冲液中，并不断搅拌，同时用pH计监测 pH值的变化，用0.5M NaOH调节pH值为7.4，室温反应12h，过滤除去不溶固 体，滤液中加入甲苯50ml，抽线g。经薄层色谱显 示有其他杂质。

　　第一步：在100ml三颈瓶中加入30ml氯仿、聚乙二醇2000单甲醚 (2.0g，1mmol)、琥珀酸酐(0.603g，6mmol)和0.5ml吡啶，60℃油浴加热回流 搅拌4h，用10ml 0.5M盐酸洗涤一次，再用水10ml洗涤两次，除去水层，用 无水硫酸钠干燥氯仿层，过夜滤掉硫酸钠，再将氯仿层转移到圆底烧瓶中，减 压蒸馏除去氯仿层，经乙酸乙酯重结晶得到聚乙二醇2000-琥珀酸酯(II)收率 84.67％。